基因治疗是近年来医学界的热门领域之一。年12月，美国食品药物管理局（FDA）批准了第一个体内（invivo）基因治疗药物Luxturna（Voretigeneneparvovec），标志着基因治疗领域又一个里程碑式的突破。近期，美国加州大学圣地亚哥分校张康教授和上海医院眼科孙晓东教授的团队在PrecisionClinicalMedicine杂志发表综述，详细总结了视网膜疾病基因治疗的最新进展和成果。结合这篇综述，本文将简要介绍基因治疗及其在视网膜疾病方面的应用。
1 基因治疗的基本介绍
众所周知，基因是一段编码蛋白质的核苷酸链，因此基因本身不能直接作为药物应用于临床，它需要经过特殊的加工包装才能导入人体细胞，再借助细胞的资源编码蛋白质来发挥治疗作用。基因治疗的概念最初源起于上世纪七十年代，经过科学家的不懈努力，从实验室的细胞到动物实验，再到临床试验，最终在几十年后变为现实，迈入了临床应用阶段造福人类。
1.1 基因治疗的重要里程碑
年，基因治疗在美国国立卫生研究院（NIH）开展的一个临床试验中首获成功。患者是4岁的AshanthiDeSilva，患有腺苷脱氨酶缺乏性重度联合免疫缺陷症（ADA-SCID），一种由ADA基因突变导致的严重的联合免疫缺陷疾病。虽然治疗是成功的，但疗效并不能持久，她需要接受两个月一次的常规注射。
年，中国深圳赛百诺公司生产的今又生（SiBionoGeneTech，Gendicine）获中国国家食品药物监督管理局批准，成为世界上首个获国家批准上市的基因治疗药物。今又生是一种携带野生型p53基因的重组腺病毒，主要用来治疗头颈部的扁平细胞癌。
年12月，Luxturna作为第一个体内基因治疗药物获得FDA批准。下文将详细介绍该药物。
1.2 作用机理
目前的基因治疗主要通过以下三种方式发挥作用：1.用治疗基因代替有缺陷的致病基因以表达必须的蛋白质；2.用治疗基因直接关闭致病基因以防止致病蛋白质的表达；3.用治疗基因表达的功能蛋白质来治疗疾病。目前最常用的是第一种方式，例如血友病、肺囊性纤维化和Leber’s先天性黑朦的基因治疗。随着基因工程发展，CRISPR/Cas9基因编辑技术为基因治疗提供了的新武器，即通过外源基因表达的核苷酸酶来对人体基因组重新编辑以治疗遗传疾病或肿瘤。
1.3 载体
基因治疗的关键之一是如何把基因载入人体细胞并成功地表达目标蛋白质，同时又不影响人体自身基因的运行。通常这个工作由载体（Vector）来完成。最常见的载体是改装过的失去毒性的“安全”病毒。目前常用的有腺病毒（Adenovirus），腺相关病毒（Adeno-associatedvirus，AAV和慢病毒（Lentivirus，一种逆转录病毒）。这些病毒都有很强的感染能力，能携带治疗基因进入人体细胞，有些甚至能整合进入染色体。然后，借助细胞的资源来生产目标蛋白质，发挥治疗功效。另外，也可以用裸DNA（NakedDNA）的形式将治疗基因带入细胞，但疗效略逊于以病毒为载体的方式。
2 视网膜疾病的基因治疗
眼球和视网膜在结构和功能上的独特优势使得视网膜疾病成为基因治疗研究的前沿阵地之一。首先，眼球是一个很小的相对密闭的系统，眼部基因治疗引起系统性并发症或副作用的可能性较小，相对于其他部位安全性更好。另外，视网膜基因治疗的注射部位视网膜下腔是免疫赦免部位之一，这意味着载体病毒不会或只引起轻微的免疫反应。这样一方面可以提高基因治疗的疗效，另一方面能避免或减少免疫反应引起的并发症。
2.1 先天性黑朦（RPE65-Leber’s，LCA2）
LCA2是一种由RPE65双等位基因突变导致的遗传性视网膜疾病。RPE65是表达于视网膜色素上皮的特异蛋白，一种视黄醇异构酶。其主要功能是把全反式视黄醛转变为11-顺视黄醛，从而逆转光异构过程（Photoisomerization），为下一个视觉循环提供必须的11-顺视黄醛。缺少RPE65或RPE65功能异常则引起全反式视黄醛淤积，光传导过程中断，最终无法产生视色素。LCA2是一种罕见的先天性疾病，新生儿中的发病率低于百万分之一。
宾州大学的JeanBennett和AlbertMaguire夫妇及其团队经过几十年的潜心研究，终于研制出基因治疗药物Luxturna（Voretigeneneparvovec）。年10月，该药物在FDA的审批过程中被授予优先审批，最终获得了审批小组16名专家的一致通过。Luxturna是携带人类RPE65cDNA的AAV2，治疗途径是视网膜下腔注射。治疗适应症还包括其他的RPE65基因突变引起的遗传性视网膜疾病，但必须是单基因致病类型，因此术前基因测试非常重要。该药由SparkTherapeutics公司生产，费用是每只眼$，。
2.2 MERTK相关的常染色体隐性遗传视网膜色素变性（RetinitisPigmentosa，RP）
视网膜色素变性是一组原发于视网膜视杆细胞的遗传性视网膜变性疾病，是最常见的视网膜致盲疾病之一，在全世界有一百多万患者。目前已知的RP突变基因有多种，MERTK基因是其中之一。MERTK是一种受体酪胺酸激酶（ReceptorTyrosineKinase，RTK），其功能是维持视网膜色素上皮细胞对感光细胞外节的吞噬作用。在MERTK相关的这类视网膜色素变性中，由于色素上皮细胞吞噬功能失常，造成视网膜下感光细胞外节废弃物堆积，最终导致视网膜色素上皮和感光细胞的死亡。动物模型实验显示，MERTK基因治疗可以地成功地保护视网膜结构及其功能。研究显示，如果在MERTK基因治疗中联合应用表达胶质细胞衍生神经营养因子的AAV，疗效会更好。在一项包含6个病人的临床I期试验中，没有发现任何AAV载体相关的并发症，而且有3个病人的视力得到了改善。但是，两年后的随访结果显示，其中2个病人的视力又有所减退。由于该基因治疗已经通过了安全性试验，研究者正在招募更多志愿者，尤其是视力仍然较好的患者，以检测治疗效果。
2.3 Usher综合症（UsherSyndrome）
Usher综合征是一种以耳聋和视网膜色素变性为特征的常染色体隐性遗传病。共有三个亚型：USH1、USH2和USH3，其中USH1是最严重的亚型。Usher综合征最常见的致病基因是MYO7A基因（或USH1b），负责编码肌凝蛋白VIIA，主要分布在内耳和视网膜。约60%的USH1b型病例是由MYO7A基因突变引起的。在动物模型shaker1小鼠中，慢病毒携带的MYO7A基因恢复了视网膜色素上皮细胞顶部运输黑色素体和转运视蛋白的功能。在此基础上，英国的OxfordBiomedica公司采用一种名为UshStat的产品开展了一个临床I期试验。该产品使用马感染性缺血病毒（EquineInfectiousAnemiaVirus，EIAV）为基础的慢病毒载体来携带MYO7A基因。然而，这种慢病毒的局限性是仅能转导至视网膜色素上皮，而不是该病最初的发病部位：感光细胞。为了解决这个问题，一种双AAV载体应用而生。由于AAV载体的容量小，不能携带较大的DNA，必须把MYO7A的cDNA分成两半再包装到两个AAV载体内。一旦进入细胞后，这两个不完整的cDNA片段又可以重新整合成一个完整的cDNA。这些双AAV载体已经在动物模型实验中成功地将MYO7A基因导入视网膜色素上皮细胞和感光细胞。在进入临床试验前，这一技术还有待进一步研究以确定其长期安全性和疗效。
2.4 Stargardt氏症（Stargardtdisease）
Stargardt氏症是一种常染色体隐性遗传的黄斑变性疾病，起病于青少年期。突变基因是ABCA4基因，编码一种ATP结合盒转运蛋白（ATPbindingcassette）。该蛋白质特异性地分布于感光细胞的外节，在视觉循环中发挥重要的作用。基因突变会造成转运蛋白功能下降或消失，毒性物质Bisretinoid滞留，引起视网膜色素上皮细胞内脂褐素（Lipofuscin）的淤积，最终导致视网膜色素上皮细胞和感光细胞变性。目前Stargardt氏症的基因治疗涉及使用不同的载体。由于ABCA4基因超出了一般AAV载体的容量，研究者在动物实验中选用了超大型AAV或双AAV载体以及慢病毒载体。其中慢病毒的效果要优于AAV，尤其是以EIAV为基础的慢病毒。在动物实验的基础上，目前有两个I/II期的临床试验来验证EIAV慢病毒的短期和长期安全性以及病毒耐受性。
2.5 其他的遗传性视网膜疾病
基因治疗研究还涉及了其他的视网膜疾病包括无脉络膜症（Choroideremia），先天性色盲（Achromatopsia）和X-染色体遗传的青少年型视网膜劈裂（X-linkedjuvenileretinoschisis）。目前针对这些罕见遗传性疾病的基因治疗都处于I/II期临床试验阶段，详情可参见张康教授综述中关于各种临床试验的总结表。
2.6 湿性老年黄斑变性
不同于那些发病率很低的遗传性视网膜疾病，湿性老年黄斑变性是65岁以上人群中最常见的致盲疾病。目前主要的治疗手段是抗血管内皮生长因子（Anti-VEGF）药物疗法，但该方法无法治愈疾病，且需要长期频繁地注射药物，不仅有眼内炎的危险，还给病人造成沉重的经济和精神负担。因此，成功的基因疗法可以造福全世界上千万的患者，临床价值极大。作为相关疾病的专科医生，这是我最