中华耳科学杂志,年19卷1期
大鼠膜迷路积水模型的建立及评定王娜李旻王静张丽李伟兰刘汝利张萍何芳
梅尼埃病（Meniere’sdisease）是一种发病机理错综复杂的内耳疾病[1]。虽然关于其病因了解甚少[2]，但膜迷路积水作为梅尼埃病的主要病理变化[3]已得到了许多学者的证实[4]。建立膜迷路积水豚鼠动物模型存在价格昂贵，对于气候适应性差，不方便操作，病死率高，模型制备成功率低等缺点[5,6]。为了避免豚鼠造模的这些不足，本实验以SD大鼠为研究对象，腹腔注射DDAVP，探讨建立大鼠膜迷路积水模型及评定方法[7]，为进一步研究奠定实验基础。
1材料与方法
1.1实验动物
选取健康SD大鼠30只（北京华阜康生物科技公司提供），雌雄不限，3～6月龄，体重～g。纳入标准:耳廓反射敏锐，鼓膜无异常，无眼震及平衡障碍。已获得我院伦理委员会批准。
1.2实验方法
30只大鼠随机分3组，实验组与对照组以4μg/kg/d分别将DDAVP、生理盐水进行腹腔注射，连续注射7d后调整剂量为6μg/kg/d，继续连续注射3d[8]，停止用药7d后分别对实验组及对照组大鼠行ABR检测，正常组不作任何处理，17d后行ABR检测。
1.3ABR检测
在声-电屏蔽室内对实验动物行ABR检测，5%水合氯醛（mg/Kg）麻醉成功后，大鼠俯卧，前额正中皮下、鼻根部、耳廓后下端皮下分别放置记录电极、接地电极、参考电极，刺激声为短声(click)，重复率21.1次/秒，刺激频率为~Hz，记录持续时间15ms，叠加次，检测大鼠ABR各指标变化。
1.4HE染色
实验动物深度麻醉后，以生理盐水和4%多聚甲醛依次行心脏灌注，断头并尽快取出耳蜗，浸泡于0.01mol/LPBS缓冲液，于蜗顶钻孔并突破圆窗、卵圆窗膜后，在显微镜下用固定液耳蜗内灌注，在4℃下多聚甲醛PBS缓冲液浸泡12小时。缓冲液浸洗30min后室温下用10%EDTA二钠溶液脱钙14天。梯度酒精脱水，石蜡包埋、切片（4μm层厚）、HE染色观察(见图1)。
1.5膜迷路积水的评价
采用软件分析系统分别计算三组大鼠SM与SM+SV，（见图2）将各组SM/SM+SV的平均值进行统计分析。
1.6统计学方法
利用SPSS22.0统计软件对实验数据进行多组间单因素方差分析，检验水准α=0.05，P0.05差异有统计学意义。
2结果
2.1造模成功率
实验组10只大鼠中有1只在造模过程中无明显行为学改变，未出现明显听力下降，耳蜗切片HE染色前庭膜平坦，未出现变形，SM与SM+SV基本等于1/3，建立模型率达90％，符合建模成功率标准。
2.2大鼠日常行为变化
实验初期，三组的大鼠自发活动及耳廓反射均正常，造模10天后，实验组大鼠逐渐出现了自发活动的减少、听觉不灵敏、步态不稳等症状，但是并未出现眼球震颤的表现，而正常组和对照组大鼠均未出现上述症状。
2.3ABR结果
通过ABR检测三组大鼠听力：通过单因素方差分析比较，实验组Ⅱ波的阈值、Ⅱ波、Ⅴ波的潜伏期及Ⅲ~Ⅴ波间期与其它两组比较，差异有统计学意义（P0.05）（见表1）。
2.4耳蜗HE染色结果
正常组及对照组耳蜗中阶（即蜗管）无明显形态结构变化，前庭膜平坦，未出现变形，而实验组耳蜗中阶发生形态结构变化，前庭膜向前庭阶的方向隆起或断裂（见图1）。
2.5膜迷路积水的评价
实验组大鼠的SM与SM+SV比值大于1/3，而正常组和对照组SM与SM+SV基本等于1/3。实验组与其它两组比较，差异有统计学意义（P0.05），正常组与对照组差异无统计学意义（见图2）。
3讨论
梅尼埃病的病因错综复杂，目前没有定论，一直处于探讨中[9]，Hallpike教授等[10]首次报道膜迷路积水是其主要病理基础后，许多学者开始通过动物实验来进一步研究其发病机理。研究者主要以豚鼠建立膜迷路积水模型，本实验以SD大鼠为研究对象，通过腹腔注射DDAVP成功造模，较传统的以豚鼠制备模型，动物容易采购，价格更低，饲养环境要求不高等优点。
针对豚鼠膜迷路积水动物造模的方法和特点进行归纳总结[11]，分为急性和慢性。急性膜迷路积水模型：①低频噪声诱发Flock、Salt等[12,13]利用噪声和增加内淋巴静态压诱导豚鼠膜迷路积水；②人工内淋巴液注射。Kakigi等[14]通过向耳蜗内注射人工内淋巴液诱导急性膜迷路积水；③霍乱毒素注射Feldman等[15]通过豚鼠耳蜗中阶注射霍乱毒素诱导出豚鼠膜迷路积水模型；④透明质酸凝胶注射Salt等[16]通过将透明质酸凝胶注入豚鼠耳蜗来诱导膜迷路积水模型。慢性膜迷路积水模型包括：①内淋巴囊手术法；②内分泌调节法：许多学者通过腹腔注射血管加压素及腹腔注射醛固酮建立豚鼠膜迷路积水模型；③免疫诱导法；④综合法。
上述在豚鼠造模方法中均存在优缺点，其中缺点有实验方法复杂、难以掌握、破坏性大、造模周期长、造模成功率低等。内分泌调节法中的腹腔注射血管加压素法诱导膜迷路积水模型是近年来研究MD动物实验常用的方法。本研究通过注射DDAVP，DDAVP是AVP的类似物，机体通过激活AVP/AQP2通路调节体内水的代谢，DDAVP受体V2R主要分布在肾脏，V2R被激活后使cAMP表达增加，而cAMP表达增加后诱导AQP2的表达水平提高，加速肾脏对水的重吸收[17]，有研究表明此通路在膜迷路积水的病理变化中也起着重要作用[18]，当体内DDAVP水平升高时通过此通路促使膜迷路积水发生[19]，通过DDAVP受体拮抗剂可以抑制膜迷路积水的进展[20]，DDAVP抗利尿作用更加强大，在内耳组织中与其受体结合，两者相互作用诱导膜迷路积水发生。
我们参照苑述刚等[8]建立膜迷路积水豚鼠模型的给药剂量及时间来复制到SD大鼠，成功诱导大鼠膜迷路积水，大鼠相对于豚鼠研究起来比较经济、操作简便，研究方便。实验中，我们从大鼠日常行为的表现定性评价，实验组大鼠逐渐出现了自发活动的减少、听觉不灵敏、步态不稳等症状，为明确大鼠的听力学变化，本实验对各组大鼠行ABR检测，结果显示实验组大鼠与正常组和对照组相比Ⅱ波阈值明显升高，且Ⅱ波、Ⅴ波的潜伏期，以及Ⅲ-Ⅴ波间期明显延长，符合梅尼埃病的听力改变的临床表现。
从微观角度去分析，本实验耳蜗HE染色显示实验组蜗管出现形态结构的改变，前庭膜凸向前庭阶或前庭膜断裂，符合膜迷路积水的病理改变，而正常组及对照组无上述形态结构的改变。此外，本研究统计结果显示蜗管横截面积与蜗管加前庭阶横截面积的比值在实验组与正常组和对照组间差异有统计学意义，提示膜迷路积水模型成功建立，进一步证实上述比值可用于客观评价膜迷路积水。
综上所述，本研究以SD大鼠为研究对象，成功制备大鼠膜迷路积水模型，分别从大鼠日常行为变化、ABR检测、耳蜗切片的HE染色、耳蜗蜗管横截面积（SM）与蜗管加前庭阶横截面积（SM+SV）的比值四方面定性及定量的去评价是否造模成功，此方法操作简单、成模时间较快、对机体无破坏性、重现性好、成功率高等优点。此研究为以后通过膜迷路积水的大鼠模型来探讨梅尼埃病奠定了动物实验基础。本实验研究也存在一定不足之处，由于本研究样本量小，大鼠DDAVP给药剂量和给药时间与造模成功率的关系及如何进一步提高大鼠建模成功率有待进一步研究，本实验只是从日常行为表现的变化上评价前庭功能有无异常，如果能给大鼠行前庭功能检查（游泳实验等），从定性定量角度去评价实验会更完善。
扫描或长按下方