最近由加布里埃拉·帕夫林科娃（GabrielaPavlinkova）BIOCEV，捷克科学院生物技术研究所，捷克共和国在听觉通路的特刊神经元上发表了一篇研究文稿。
抽象
这篇综述提供了耳蜗中主要听觉神经元或螺旋神经节神经元的最新信息来源。这些神经元以电信号的形式将听觉信息从感觉毛细胞传递到脑干的第一个听觉核（即耳蜗核）。先天性和后天性神经感觉性听力损失影响全球数百万人。越来越多的证据表明，主要的听觉神经元由于噪声暴露和衰老比感觉细胞更容易退化，因此，听觉神经元是再生治疗的主要目标。更好地了解这些神经元的发育和功能是长期维持，再生和干细胞替代疗法的最终目标。
1.简介
根据世界卫生组织的统计，听力障碍是部分或全部无法听见声音的疾病，是当今社会十大障碍之一，约占世界人口的6％。神经感觉性听力丧失是永久性的，是由于无法再生的神经元或感觉细胞死亡而导致的。听觉神经元是听觉途径的重要组成部分，因为它们将听觉信息从感觉毛细胞传递到脑干的耳蜗核。当前的用于听力障碍的有效疗法利用助听器来增强毛细胞刺激或使用耳蜗植入物代替毛细胞。这些医疗设备要求内耳中存在功能性听觉神经元。因此，最近的研究集中在神经元置换的可能性上，包括外源性干细胞移植和内源性细胞源替代。转录网络是控制干细胞听神经元再生或替换的关键。了解和识别与听觉神经元的发育和存活有关的个体转录因子，对于将来更有效的听力损失治疗至关重要[1]。这篇综述着重于听神经元研究的最新进展和对本研究未来方向的新观点，尤其是对听神经元的发展和维持重要的分子因素。
2.听觉神经元的功能多样性
哺乳动物内耳内存在两个可区分的神经元系统，称为降序神经元通路和升序神经元通路。
从皮层下降的通路称为传出系统或少毛系统。虽然对于听觉区域来说是唯一的，但它由细分为内侧小耳小肠传出和外侧小耳小肠传出的传出神经元组成。传出来自面部分支运动神经元。这些组在神经元体的位置和髓鞘形成程度方面有所不同。较厚的髓鞘内侧传出物与耳蜗中Corti器官的外毛细胞形成突触（图1A）。薄而无髓鞘的侧向神经支配连接内部毛细胞的神经纤维的树突。该途径使用乙酰胆碱作为主要的神经递质。传出系统涉及信号检测的改善，外部毛细胞的功能以及保护耳蜗免受声学损伤。耳蜗系统效率的差异是造成永久性声损伤的关键因素。
图1.听觉神经元在耳蜗中形成螺旋神经节，并将Corti器官中的毛细胞连接至脑干的耳蜗核。（一）图显示了Corti器官的神经支配。I型神经元向内毛细胞延伸放射状纤维（5-30个I型神经元使一个内毛细胞受神经支配），II型神经元向耳蜗内的外毛细胞和支持细胞提供分散的神经支配。来自上层橄榄复合体的传出轴突支配外部毛细胞。（B）整个小鼠耳蜗的免疫标记显示形成Corti（OC）器官的外毛细胞（OHC，用抗-Prestin标记）和内毛细胞（IHC，用抗钙黄蛋白标记）。（C）螺旋神经节（SG）神经元的全量免疫染色（抗NeuN，一种神经元体标记）显示树突在外围延伸至Corti（OC）器官，而轴突则向中枢神经系统移动（抗乙酰化的α-微管蛋白标记的神经纤维）。比例尺，50μm。从未发布的数据中获取的共焦图像（B）。（D）内部毛细胞上I型神经元的分子亚型的突触示意图。I型神经元被分为三个不同的组：螺旋听觉神经元的Ia型（蓝色），Ib型（品红色）和Ic型（绿蓝色），它们扩展了在IHC表面上空间隔离的外围过程。HS：Hoechst核染色。
形成上升的神经元通路的神经元支配着耳蜗Corti器官的感觉上皮，并以电信号的形式将听觉信息传递到大脑（图1A）。听神经元的躯体形成螺旋神经节，在螺旋状的耳蜗管内扭曲。支配Corti器官毛细胞的周围神经元过程被称为树突，而中枢过程为轴突（图1）。公元前）。它们大多数是有髓的，这被认为是轴突的特征。传入神经元的轴突合并到前庭耳蜗神经（也称为VIII颅神经）中，将声音信息进一步传递到中枢神经系统。耳蜗中已描述了两种类型的听觉神经元（图1A；）。大型，有髓，双极I型神经元将Corti器官中的内部毛细胞连接到大脑的耳蜗核。较小的伪单极II型神经元将外部毛细胞连接到耳蜗核，其外围过程保持无髓鞘和稀薄状态。I型神经元代表螺旋神经节中所有神经元的大部分（约95％），总共5-30个I型神经元支配着耳蜗中的一个内部毛细胞。相反，II型螺旋神经节神经元接收从几十外毛细胞的输入，以及支持细胞。II型听觉神经元出现在疼痛信号传导和损伤感知发挥作用。I型神经元可以被进一步划分为三个遗传学上不同的亚型，被称为Ia型，Ib和Ic。这些亚类表现出显着的变化，例如转录因子，神经递质受体，通道亚基或细胞粘附分子表达的差异。Ia，Ib和Ic型神经元显示不同的空间排列，并且在有限的频率范围内具有高选择性。此外，I型螺旋神经节神经元表现出自发放电速率（SR）的差异。因此，它们可以被归类为低SR，介质-SR和高SR纤维和单内毛细胞似乎通过与不同的SR纤维神经支配的图1D）。尽管听觉神经元的总数随着年龄的增长而减少，但是Ic型神经元似乎特别容易受到噪音或衰老的影响。
3.耳蜗听神经元的异位组织
在听觉系统中，耳蜗感觉毛细胞通过螺旋神经节神经元连接到大脑，螺旋神经节神经元根据频率以一种有序的方式组织在耳蜗内，即所谓的音调组织，在基部具有高频，在基部具有低频、顶点。螺旋神经节神经元的位置沿着耳蜗的音调轴与从内部毛细胞接收的输入频率相关（图2A）。听神经元的表型以及由此而来的色调图谱的形成也受到基底顶神经营养蛋白梯度，脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养蛋白3（NT-3）的影响。在耳蜗中，神经营养蛋白BDNF和NT-3均在发育的感觉上皮中产生，而它们各自的受体神经营养性酪氨酸激酶2型受体（TrkB）和神经营养性酪氨酸激酶3型受体（TrkC）在听神经元。NT-3和BDNF以相反的根基-基底梯度表达，其中NT-3的最高水平在碱基中。神经营养蛋白不仅影响存活，还影响轴突的引导和听神经元放电特性的成熟。
图2。色调组织。（A）在整个频谱上的耳蜗及其音调图示。高频声音最大程度地刺激耳蜗根部（红色），而低频声音最大程度地刺激耳尖（绿色）。（B）亲脂性染料示踪可以显示耳蜗核的异位组织。不同颜色的染料（洋红色，前庭器官；红色，基色和绿色，顶点）的应用示意图，用于标记投射到耳蜗和前庭核的听神经神经元纤维的不同束。耳蜗的三染料标记的代表性图像显示了低（听觉为绿色）和高频（听觉为红色）听觉神经纤维的轨迹以及耳蜗核细分，前腹（AVCN）的鼻位组织胚胎第18.5天时，在小鼠胚胎中的后耳蜗和耳蜗背核（DCN）。图片来自参考文献[6]。
由于耳蜗内有专门的神经支配，听觉过程会响应狭窄的频率范围，在一个特定的频率上响应最大。它定义为单个听觉神经纤维最敏感的声音频率，即特征频率。复杂声音的检测取决于听觉神经元亚型的特性，尤其取决于自发放电速度，以及这些神经元亚型沿音位轴的比例。这些亚型的分布因物种而异。贯穿听觉通路直至皮层都保持了音位（或耳蜗位）组织。地形图的形成需要将耳蜗的螺旋神经节神经元传入精确投影到后脑的第一个听觉核，即耳蜗核上（图2B）。通过听轴突相对于它们在螺旋神经节中的起源位置的精确分布，印记了耳蜗核的顶峰。
4.耳蜗听觉神经元的分子多样性
最近，单个细胞的转录组谱分析已成为研究细胞多样性的有效方法。在耳蜗使用成熟听觉神经元的转录组分析，I型和II型神经元和I型螺旋神经节神经元进行了表征[三个亚型之间的分子差异]。独特的和组合的分子图谱根据其功能特性，将四种不同类型的成熟螺旋神经节神经元分别对应于听觉神经元的分类。例如，Ngfr表达的差异I型和II型螺旋神经节神经元之间编码p75神经营养蛋白受体的基因与它们对神经营养蛋白和损伤反应的差异相关。此外，差异表达模式表明II型神经元内的异位异质性，表明II型根尖和基底神经元可能具有不同的功能。根据转录组分析，I型螺旋神经节神经元被分为三种不同的亚型：Ia，Ib和Ic，分别占小鼠耳蜗神经元总数的35％，40％和25％。另外，这些亚型的神经元的比例沿小鼠耳蜗的舌面轴不同，与其余的耳蜗相比，耳蜗基底中Ia神经元的比例较大，而Ib神经元的比例较小。每个神经元亚型都表达一组独特的基因，这些基因编码Ca2+结合蛋白，K+通道和Na+通道亚基会根据对声音和自发发射速率的敏感性影响其响应特性。自发和感觉输入促进螺旋神经节神经元的I型和II型和I型亚类的成熟和连通性。这些过程受到编码毛细胞机械转导成分的基因突变的不利影响。例如，Tmie和Pcdh15中的突变中断了Ia，Ib和Ic神经元亚型的转导和规范]。因此，毛细胞中的功能性机械转导对于表达表征听觉神经元的不同类型和亚型的分子标记物至关重要。然而，所有四种类型的听觉神经元在出生时就存在，这表明耳蜗的初始神经元多样化与Corti器官的活动模式和出生后成熟无关。
螺旋神经节神经元的生理特性和分子表达谱中的潜在差异也可能影响这些神经元如何将信号传递到脑干的耳蜗核细分中的靶标。单细胞转录组分析显示编码轴突蛋白的表达基因中的分子差异，包括谷氨酸受体Grm8，胞吐调节剂Cplx2和netrin家族基因Ntng1。轴突蛋白表达的差异可能会影响螺旋神经节神经元不同亚型的突触特性和连通性。
5.内耳神经元发育
神经元的发展与内耳的形态发生同时进行（图3）。内耳的所有感觉器官及其相关的感觉神经节均来自单个胚胎来源，即耳斑。从耳placode诱导和内耳的形态代表高度协调由转录因子和信号分子调节的过程（通过审查）。当耳部斑块侵入并形成耳囊时，神经发生是由表达神经元前体的前神经bHLH转录因子Neurogenin1（Neurog1）的表达开始的，然后是另一种bHLH转录因子Neurod1的表达。耳上皮细胞内成神经细胞的最初特性是，最早在小鼠胚胎的胚胎第九天（E9）时，耳胚前腹区域的神经母细胞就会分层。分层后不久，成神经细胞强烈表达bHLH基因Neurod1，增殖并形成耳蜗前庭神经节（图3A，B）。在检查的所有物种中，神经元似乎是发育中的内耳中最早分化的细胞。然而，内耳结构，包括用于听力的结构中，物种[之间变化]。神经发生的关键步骤是听觉和前庭神经元的分离，因为耳蜗-前庭神经节分离为内侧螺旋神经节和外侧前庭神经节。尚未完全了解调节听觉和前庭神经元的规格和分离的分子线索。目前的证据表明，在Neurog1表达之前或之后不久，听觉和前庭神经元的发育在空间和时间上是分离的（综述）。经过一段时间的增殖后，所有神经元都会经历其最终的细胞分裂并开始分化。随着神经元的成熟，有丝分裂后的听觉和前庭神经元将其过程扩展到其外周靶点（Corti器官和五个前庭感觉上皮）和中心靶点（脑干的耳蜗和前庭核）。内耳的神经元的中央突起到达后脑如在小鼠[早E11.5]。E12.5是最早天胚胎检测听觉神经元的中央隔离凸出到耳蜗核从前庭神经在小鼠。这是外围投影达到目标的时间。小鼠的听觉神经元从耳蜗底部开始，在小鼠的E12.5周围成熟并扩展其周围神经突。听神经元表达两种神经营养蛋白受体，即TrkB和TrkC，这取决于它们沿耳蜗轴的位置，这表明来自耳蜗不同区域的轴突中的这些分子差异指导了地形图的形成。感觉上皮细胞表达的发育中听觉神经元中存在的两种受体及其各自的神经营养蛋白（BDNF和NT-3），不仅对轴突的引导至关重要，而且对神经元的存活，突触形成和射击的成熟至关重要。
图3。内耳神经节的形态发生。（A）通过检测Isl1mRNA原位杂交来观察在E10.5在小鼠胚胎中形成耳蜗前庭神经节的神经元。图片来自参考文献。（B）在耳囊的神经感觉上皮中检测到NEUROD1+分层神经母细胞。经参考文献许可的共焦图像。比例尺，μm。（C）从耳囊到成熟的三维结构，示意性地显示了内耳形态发生的阶段。平行地，神经元首先分层以形成耳蜗-前庭神经节（CVG），然后逐渐分离前庭（VG，绿色）和螺旋（SG，红色）神经节，最终使神经前庭和听觉感觉上皮神经支配。cd，耳蜗管；HS，赫斯特核染色；SVG，前庭上神经节；和IVG，前庭下神经节。
6.内耳神经元发育和维持中的转录网络
内耳神经元的规格，迁移，分化和存活受到转录因子和信号分子的复杂网络的调节。转基因小鼠模型的利用揭示了许多基本转录因子的作用，这些转录因子控制着内耳听神经元的规范，分化和成熟的时间和空间触发因素。尽管两个神经元和感觉主细胞命运决定是相继做出的，但它们是相互依存的，因为协调神经节形成的调节网络和内耳感觉器官是相互联系的。
6.1。SRY（性别决定区域Y）-框2（SOX2）在神经源性和感官性祖细胞中。
SOX2对于维持各种发育系统中未分化的神经感觉细胞状态至关重要。在发育中的耳朵中，所有具有增殖和分化能力的前体都表达SOX2。尽管SOX2在耳廓细胞中表达，但对于耳廓斑块内陷和耳囊的形成不是必需的。SOX2的感官发展保持感官前体的必要性已经建立。尽管通过耳部斑块表达的Sox2与最早形成的神经元重叠，但其在神经发生中的作用尚不清楚。Lcc中缺少SOX2表达突变体（光涂层和盘旋，其突变体具有在增强的X射线辐射诱导的突变的Sox2在显影内耳）在E15.5已经与后期不存在的神经元的。附加令人信服的证据表明的延迟缺失Sox2的结果截断神经发生在耳蜗。由Isl1Cre产生的Sox2的延迟缺失导致仅在基底耳蜗转向中分化较差的Myo7a+感觉毛细胞，严重减少和改变了神经支配（Sox2CKO;图4A，B）。但是，最近的一项研究表明，在耳部斑块水平上消除Sox2对早期神经发生，Neurod1表达以及具有周围和中央突起的前庭神经节的形成没有影响。相比之下，在未充分卷曲的耳蜗中未发现神经元神经支配，这提示听神经元发育中SOX2的存在存在不同的要求。在缺少Sox2的情况下缺乏感觉发育并缺少感觉上皮产生的神经营养支持导致所有耳朵神经元大量凋亡。SOX2的与其他转录因子的相互作用可能代表的潜在机制，允许耳发展[期间在不同的细胞谱系的SOX2不同角色]。
图4.耳蜗中的差异神经支配表型作为消除转录因子的作用。（A）用抗Myo7a（一种毛细胞，HCs的标志物）和抗β-微管蛋白（神经纤维）抗体进行的全量免疫染色显示了小鼠对照耳蜗中感觉上皮和毛细胞的神经支配和形成。出生后第0天。（B）延迟删除SRY（性别决定区域Y）-box2（Sox2），（C）Neurod1，以及（D）Neurod1和Atoh1的双重删除是由Isl1Cre并导致神经元数量异常，感觉上皮形成和耳蜗神经支配。比例尺，50μm。（D）经参考文献允许。
6.2。神经发生中的bHLH转录因子
bHLH因子NEUROG1和NEUROD1均可促进内耳的神经元命运。NEUROG1是用于神经发生诱导的必需基因，如消除NEUROG1在完全不存在内耳神经元。没有NEUROG1不仅消除了神经元发育，但也影响感官的发展，导致在顶点[具有内和外毛细胞的多行显著缩短耳蜗]。耳囊前神经感觉结构域中表达Neurog1的前体也分化为感觉细胞，表明Neurog1+前体的感觉和神经元命运不完全隔离。因此，一些前体可以分化为感觉细胞或神经元。
NEUROD1在分层神经母细胞高表达，并NEUROD1无效突变最终失去大部分的感觉神经元中。像Neurog1-null小鼠一样，Neurod1-null突变体的耳蜗较短，并且感觉细胞杂乱无章。发育中的神经元分层后，Neurod1的延迟缺失表明NEUROD1参与前庭和听觉神经元的分离以及周围和中央投射的调节。Neurod1的Corti器官的组织条件缺失突变体与对照相当，具有三排外部毛细胞和一排内部毛细胞（Neurod1CKO；图4C）。尽管在突变型耳蜗中发现了密集的放射状纤维，但仍存在与神经元减少和异常迁移相关的明显异常现象（例如，放射状纤维束之间的间距增加，传出的轴突未形成神经节内螺旋束和混乱的中央轴突）。因此，Neurod1的缺失会影响耳蜗的音调组织，从而导致杂乱的主要音调图和中央听觉系统中声音信号处理的特征发生变化。此外，还有一种新颖的Neurod1和Atoh1的双缺失突变体证明，NEUROD1-deprived听觉神经元形成没有任何感觉细胞突起存在于后耳蜗Atoh1的消除（NEUROD1;Atoh1CKO;图4d）。这项研究表明，带有Neurod1缺失的听觉神经元能够自动生长轴突并形成神经元投射细胞。因此，NEUROD1在神经元分支的调节，突出的传入和传出纤维的组织以及听觉系统的声调组织中具有特别重要的作用。
6.3。ISL1在内耳神经元和感觉系的发展
ISL1是一个Lim同源域转录因子，可以以单体或异多聚体转录因子复合物的形式与DNA结合，即“LIM代码”。ISL1有助于神经元和非神经元细胞类型，包括运动，感觉和交感神经元发展和胰腺内分泌和心肌细胞。在耳发展，ISL1在耳蜗前庭神经节的分化神经元和耳[prosensory前体表达的]。具有Isl1转基因调控的模型表达表明ISL1的重要作用在神经元和毛细胞的内耳维护和功能，并且也作为在感觉神经变性[可能的贡献因素]。ISL1表达模式表明在神经元和感觉细胞的规范和分化中起作用。但是，功能丧失的Isl1突变体的早期胚胎致死性无法全面评估其在耳朵发育中的作用。
6.4。转录因子组合确定听觉神经元多样性。
最近的单细胞RNA测序鉴定转录因子特异于不同类型的听觉神经元，。例如，POU4F1，在POU（PIT-OCT-UNC）家族的转录因子的成员，更强烈地在I型神经元中表达，与IC类型[最高水平]。最初，随着神经发生的发生，Pou4f1在所有听觉神经元中广泛表达，其种系缺失导致明显的寻路缺陷和神经元的部分丢失。听神经元的子集，保留Pou4f1的表达除听力发作外，在突触前特性中起指导作用。
相比之下，Runx1（与侏儒相关的转录因子1）主要在Ia和Ib型神经元中表达，尽管其功能尚不清楚。在某些神经祖细胞群中，Runx1控制神经元分化并增加Neurod1的表达，以及神经营养蛋白敏感性和轴突靶向。
II型听觉神经元在螺旋神经节中占神经元的5％，在形态上和分子上都与I型神经元不同。他们不是为的声音信息传递必要的，但似乎在损伤反应和疼痛信号作用。它们出生后，其特征在于特定的表达式ETV4和Prox1的和增加的表达MAFB和GATA3。在发育过程中，Gata3首先在所有内耳神经元中表达。早期淘汰Gata3导致在耳蜗[无的感觉神经细胞分化]，而延迟条件GATA3缺失严重破坏耳蜗布线和杂乱无章原因和过早地延长神经突耳蜗中的。尽管Gata3在成熟的II型听觉神经元中表达，但在这些神经元中的功能作用仍不清楚。
7.基于细胞的神经元置换疗法
由于感觉细胞和听觉神经元几乎没有再生能力，仅干细胞工程学的最新进展增加了基于细胞的治疗听力障碍的可行性。对于听力障碍和人工耳蜗技术的未来发展，替换听神经元的方法学的发展具有巨大的临床潜力。只有了解正常的神经元发育以及内耳神经元功能障碍和退化所涉及的机制，才能实现该目标。
替换神经元的一个方向是重新编程内耳中的内源性细胞，这将更加生理。在内耳表示干细胞特性增殖细胞通过几组标识。然而，耳蜗中干细胞的数量非常有限。通过用病毒介导的Neurog1和Neurod1异位表达诱导耳蜗非感觉上皮细胞的神经元命运，尝试了另一种尝试。虽然Neurog1和Neurod1转染的细胞表现出神经元表型，这种转录因子诱导的重编程本身不足以在耳蜗外植体中生成成熟的神经元。另外，在非感觉上皮细胞中诱导神经元命运的能力主要限于小鼠的胚胎发育。新神经元的另一个来源可能是螺旋神经节中存在神经胶质细胞。胶质细胞已经通过病毒介导的转录因子和小分子可溶性分子在大脑中异位表达而被重新编程为功能性神经元，这代表了一种可能的未来治疗听力损失的方法。
神经元替代的第二个方向是使用外源多能干细胞（PSC）。PSC具有自我更新的能力，并能够分化为多种细胞类型。PSC的来源有两种：胚胎干细胞（ESC）和通过体细胞重编程产生的诱导性多能干细胞（iPSC）。PSC已用于产生内耳细胞，用于基于细胞的治疗和体外分析（图5）。对于基于细胞的治疗，可以在分化的任何阶段移植PSC，以避免分化的神经元普遍发生凋亡。这也将允许在神经元分化过程中引入内耳环境的局部线索，以促进神经突生长和突触形成以产生功能性神经元。几个分化方案产生感觉神经元样从小鼠和人的PSC细胞已建立的。为了避免免疫相容性问题，使用源自患者自身细胞的iPSC是有利的。神经元移植的当前挑战包括细胞存活，分化和突触连接的形成。尽管如此，PSC衍生的3D人耳蜗类器官代表了一种强大的工具，可用于研究听力障碍的分子机制，并利用例如簇状规则间隔的短回文重复（CRISPR）/Cas9技术以及验证基于药物的疗法。总之，在体外和体内神经元的产生以及移植方案中已经取得了重大进展，但是还需要进一步的工作来优化听力功能的恢复并能够在异位组织移植的细胞。
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