（科研学渣小白入门，翻译理解可能有误，望纠正！）
Organoidsasaninvitromodelofhumandevelopmentanddisease
AliyaFatehullah,SiHuiTanandNickBarker，
一、前述
长期以来，因无法在体外长期维持和扩增成体干细胞并保持其多谱系潜力，人类干细胞的临床应用一直受到阻碍。随着对干细胞niche、干细胞维持和分化中的信号调节因子的了解，以及体外3D培养技术的发展，推动了能自我更新的类器官的发展。
过去，类器官被泛指各种器官型培养物，来源于原始组织、胚胎干细胞ESC和诱导多能干细胞iPSC、已建立的细胞系以及完整或部分的器官(如器官外植体)等。此文研究者对类器官的定义为，仅源自原始组织、ESC或iPSC的体外3D细胞簇，其能够自我更新和自我组织，并表现出与原始组织相似的功能。
先前发表的大多数类器官培养物，具有功能性单位，但缺少组织内散在的间充质、基质、免疫和神经细胞等部分。而且，形成的类器官培养物依赖于细胞外基质（ECM）来形成与naivetissue相似的结构。与传统体外培养物不同，现在的类器官具有与原始组织相似的组成和结构，有少量能自我更新的干细胞，可以产生所有主要谱系的后代，类似于体内组织。Besides，类器官可无限expanded，可作为生物库进行低温保存。What’smore，原始组织衍生的类器官没有间充质/基质，更方便地研究感兴趣的单一类型组织。
Inshort，类器官，比单层培养模型更具生理学意义，比体内模型更容易操纵niche成分、信号通路和进行基因组编辑，是传统2D培养和体内模型之间的重要桥梁。
二、初始3D类器官培养
3D类器官培养最先为年的肠道类器官培养系统的开发。这种新的方法提供一种定义明确、稳定的培养系统，能够长期维持来自Lgr5+干细胞或分离隐窝的上皮组织的生长。该技术产生的3D培养物，具有明显的隐窝状和绒毛状结构域，border一个包含有上皮中挤出的死亡细胞的中央管腔，同时具有干细胞、祖细胞和所有分化类型的细胞。Hereafter，人类肠道类器官、其他含Lgr5+干细胞的器官（如结肠、胃和肝脏等）的类器官都通过该3D系统开发出来了。
该培养系统被称为R-spondin法：使用Matrigel作为ECM替代品，加入niche信号的生长因子：Frizzled/LRP的配体WNT；促进干细胞扩增的BMP抑制剂Noggin；维持干细胞数量的WNT激动剂、Lgr4/5的配体R-spondin。
三、类器官优势、不足和应对策略
①类器官优势：
来源多样：成人和胎儿组织，ESC和iPSC
适用于各种已建立的实验技术
成体干细胞在类器官中增殖，并且可纯化特定谱系
极少的起始材料便可扩增到多种应用
能增殖而不发生基因突变
产生涵盖多种组织成分的类器官
近生理状态的研究模型
患者衍生的类器官可得到动物中难建模的人类疾病模型
产生同源成体组织用于移植
②缺陷/不足：
无法研究native微环境中干细胞与其niche、免疫细胞等的相互作用
培养系统中缺乏免疫细胞，在模拟对感染或药物的炎症反应方面的应用有限
Matrigel中无法模拟体内生长因子的梯度
无法模仿干细胞在体内遇到的生物力学压力
ECM限制药物的渗透，阻碍了类器官在药物筛选中的使用
难以从niche还不了解的组织培养出类器官，如卵巢
类器官在活力、大小和形状上的不同使表型筛选变得复杂
类器官培养依赖于小鼠肉瘤衍生的Matrigel，阻碍类器官移植。
③应对的策略：
与器官型培养系统互补，或与其他类型的细胞如基质细胞或免疫细胞共培养
应用微流控技术产生浓度梯度
寻找新的底物和ECM体外模拟生物力的相互作用
改变ECM的物理属性，如成分，孔隙度和刚度
筛选重要信号通路的小分子调节剂和特定激素作为潜在的培养成分
通过实时或延时成像单独追踪类器官
开发更明确的支持类器官生长的细胞外基质，符合人体移植的规定。
四、原始组织来源的类器官
①目前包括从舌头到结肠的小鼠胃肠道类器官
表达bmi1的细胞（成体干细胞标志）来源的球形舌体类器官。
表达Lgr5或Lgr6(成体干细胞标记)的的味蕾类器官。
唾液腺原球细胞来源的唾液腺类器官。
②成体来源的肝脏和胰腺的类器官
肝胆管碎片来源的囊性肝类器官。
胰管的成体组织产生芽状的囊性类器官。腺泡细胞产生的导管样类器官。分泌细胞的培养物。将这些胰腺类器官植入肾小球，能产生包含导管、内分泌和腺泡细胞的功能性胰腺组织。
③原始新生儿组织来源的肺类器官
小鼠胚肺细胞来源的肺类类器官。
④类器官培养
食管类器官培养中，将胃泌素添加到以R-spondin的培养基中有助于产生类器官。该方法稍微改变也适用于培养幽门和胃体区域的胃类器官。
增殖性类器官的分化需要从幽门培养物中撤出WNT3A和FGF10，或从胃体培养物中撤出WNT3A，FGF10和Noggin。
WNT（例如，抑制GSK3β（糖原合酶激酶3β）的CHIR）和Notch信号通路（例如，抑制组蛋白脱乙酰基酶的丙戊酸）的调节因子有助于丰富和维持干细胞群，更容易成功培养类器官。
干细胞在类器官中维持并永久存在，不断产生分化的后代。典型的形态可分为球形、分枝或芽生。
⑤类器官的突破：体外长期培养，活检组织和循环肿瘤细胞来源
人肝类器官也已成功地从健康的活检样本中获得。
使用Wnt激活剂和TGF-β抑制剂的特定鸡尾酒，Boj等人报道，人胰腺类器官可保存长达6个月，并冷冻保存。
患者的肿瘤活检和循环肿瘤细胞可以产生与原发肿瘤相似的类器官。
五、ESCsandiPSCs来源的类器官
①内胚层
胃肠道：
内胚层组织来源的ESC和iPSC中，刺激TGF-β信号形成内胚层，然后根据培养条件分化为胚胎肠道的相关部分。另一项研究，用外源WNT3a的成纤维细胞条件培养基，培养小鼠和人ESCs的内胚层细胞。
人ESCs和IPSCs来源的内胚层细胞加入FGF4和WNT3a，形成后肠和肠道类器官。
对鼠ESC来源的内胚层诱导Barx1表达，并同时调控SHH和WNT信号途径，将内胚层分化为胃类器官。
肝肺部：
iPSC衍生的肝芽，短期培养后移植生成了血管化的、有功能的肝组织。
通过ActivinA和Notch信号通路，产生人iPSC衍生的功能性胆管类器官。
人ESC来源的内皮细胞中添加Hedgehog激动剂，产生表达近端和远端肺标记的上皮类器官。But，这与来自原始胎儿组织的不同，类器官培养物中没有观察到分枝。
②外胚层：
ESCs和IPSCs被诱导形成类胚体(EB)状聚集体，这些聚集体经过外胚层特化后，走向神经或非神经的命运。
从小鼠ESC产生视网膜类器官。
Eiraku等人首创的SFEBq(无血清培养类胚体状聚集体)方法产生端脑类配体，Lancaster等人使用旋转的生物反应器，产生重现大脑多个区域的类器官。从这两种方法得到的脑器官显示出离散的皮质层和增殖的祖细胞区，其中含有胶质细胞和能够电刺激的神经元，与人类大脑发育的早期阶段相似。
从鼠ESC衍生出非神经外胚层的内耳类器官。
③中胚层：
人iPSCs诱导分化，通过中间中胚层状态产生肾类类器官。
人类肾脏类器官的3D模型，克服了2D单层、短期3D聚集体和与小鼠成纤维细胞共培养的局限性。
六、类器官基础/科学研究的应用
①总：分析干细胞特性、niche研究、药物筛选、疾病建模、基因编辑与治疗、病原宿主相互作用的研究、生物类器官库。
②胚胎发育过程：
ESCs、IPSCs和胎儿组织产生的类器官保留了它们最初发育阶段的特征，可诱导细胞分化获得胚胎发育的变化过程。
③研究胚胎谱系特化：
IPSCs和ESCs向类器官的逐步分化，研究胃、脑和胰腺等组织的发育过程。通过调节WNT、BMP和FGF等信号通路实现了特定类器官的形成，阐明了形成这些组织的信号网络。
④信号网络间的相互作用：
胎儿肺类器官被用于研究内皮网络必需的外源FGF与抑制内皮网络形成的VEGF-A以及诱导上皮和内皮形态发生的SHH的相互作用。
⑤研究组织内稳态调控、疾病的发生机制和相应症状。
⑥难获取细胞的研究/难动物建模的人体疾病的研究：
类器官的自我更新能力促进了原代上皮细胞从非常有限的起始材料扩增，用于表达谱研究或体内难获取的细胞谱系的研究。
某些人类疾病非常难以在动物身上建模，比如那些影响人类大脑发育的疾病。因此，来自成人组织和ESC的患者来源的类器官是解剖这些疾病病理的另一种方法。例如，对因CDK5RAP2基因功能缺失突变导致的小头症患者的神经类器官的研究表明，无功能的CDK5RAP2导致过早的神经分化，导致大脑发育不良。类似地，自闭症患者iPSC衍生的类器官转录组分析发现，这些患者产生了过度的GABAergic抑制神经元。
⑦模拟宿主-微生物相互作用：
幽门螺杆菌是人类胃炎和胃癌的病因，可有效地定居人胃类器官的腔上皮，导致重大的生理变化，包括致癌的CagA引起的增殖增加和β-catenin信号增强。
一些3D组织模型已被用于研究微生物发病机理，例如由产志贺毒素的大肠杆菌引起的溶血性尿毒症综合征。
肾脏类器官允许研究细菌定植的细胞以及随后在组织中的症状。
⑧结合CRISPR/Cas9来研究疾病：
CRISPR/Cas9基因编辑健康类器官，评估候选基因在组织生理学和癌变中的功能。
将系列突变引入健康的人类结肠类器官，能够驱动原位或向肾囊移植后体内癌症形成的癌症类器官。
鼠类器官也被用来模拟原癌基因Kras在胰腺肿瘤中的作用。比较正常小鼠与原癌基因kras类器官的基因表达和蛋白质组学特征，得到对腺癌进展的信号通路和驱动基因。
七、类器官与疾病治疗
①有效药物筛选：
类器官高通量筛选有效药物。如，Ogawa等人使用抑制剂来纠正患者来源的胆管类器官中CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节因子)的错误折叠和向细胞膜的移位。
②精准治疗：
患者衍生的类器官应用于个性化治疗。疾病活检的患者类器官进行体外扩增后深度测序，可揭示致病突变，或者深入表型分析，促进更有针对性的治疗方案。
从患者体内培养出相匹配的健康和患病类器官能够筛选选择性靶向患病组织的药物组合，有助于确定副作用最小的更有效的治疗方法。
③毒性预测：
抗癌药物的许多副作用可归因于急性肝毒性。在开始昂贵的临床试验之前，使用肝脏类器官来预测药物组合的体内肝脏毒性。
④耐药性：
类器官预测耐药性的获得、筛选靶向癌症干细胞的药物。
⑤预后预测：
结合4D显微镜，可以随着时间的推移跟踪类器官，以评估肿瘤干细胞的行为和活性，从而预测患者的预后。
⑥再生医学：
Ⅰ：扩增或者iPSC技术从组织活检(如皮肤)中产生同基因或HLA匹配的组织特异性类器官。
Ⅱ：使用基因编辑技术修复遗传缺陷产生健康的同源上皮进行原位移植。
Dekkers等人证明了这种方法的可行性，他们利用患者来源的结肠类器官进行CRISPR/Cas9基因编辑来纠正CFTR突变，从而恢复酶功能，生成能够在移植后重新填充患病组织的健康上皮。
Ⅲ：已经在结肠、胰腺和肝脏中进行类器官功能性植入治疗疾病和修复损伤组织。
Ⅳ：患者来源的类器官同样适用于治疗溃疡性结肠炎、克罗恩病和胃食管反流病，以及肾脏疾病和肝硬化。虽然目前还不可能，但优化胰腺类器官培养以维持胰祖细胞和朗格汉斯的功能性β细胞或胰岛可能治疗糖尿病。
Ⅴ：神经类器官将为治疗一系列神经退行性疾病(如脊髓损伤和帕金森氏病)提供极好的健康组织来源。
八、不足
①非预期谱系的分化：
与原生组织的来源的类配体相比，从ESCs/iPSCs来源的类配体会产生非预期谱系的细胞类型。因为用于ESCs/ipscs定向分化的因子并不能完全有效地驱使所有细胞向所选择的谱系分化。
②组织器官的复杂结构：
许多外胚层和内胚层类器官，如肠、胃和肾，存在limited的间充质细胞类型。
缺乏免疫细胞等成分限制了它们在炎症性反应模型的应用。
类器官的活力、大小和形状等的异质性，使得药物毒性和有效性的分析变得复杂。活体成像技术使类器官反应得到实时分析，对异质性详细表征，有助于克服这一限制。
③微环境信号：
如皮肤或卵巢等一些组织resistantto类器官培养，目前以3D形式作为全组织外植体或器官型/机械支持的培养物（例）进行培养。成功的培养类器官需要进一步了解内源性干细胞niche和控制这些组织谱系的信号和器官特异性激素。
④信号浓度梯度：
某些组织中的类器官生长依赖于生长因子/信号梯度来维持干细胞更新和谱系分化。目前使用微流控技术来形成更接近体内情况的浓度梯度。
⑤ECM特性：
细胞外基质比较硬限制了药物的渗透。
ECM物理属性的变化，如成分、孔隙率和硬度，也应能模拟ECM与肿瘤侵袭边沿之间的相互作用，才能筛选阻断肿瘤侵袭过程中对ECM的重塑。
由于不可预见的感染和免疫/宿主排斥反应的风险，依赖于小鼠肉瘤来源的Matrigel作为3D基质在类器官培养中阻碍了人类类器官在临床移植中的应用。
⑦机械力因素：
体内干细胞的行为和细胞分化也受到局部生物机械力的影响，例如与细胞外基质相互作用产生的力，这些机械/生物力在体外很难模拟。
九、小结
来源于原始组织、ESC/iPSC的3D类器官能够不断增殖，体外长期培养并且不发生变异，具有与原生理条件下非常接近的器官组织结构和功能。目前已成功培养包括口腔食管唾液腺、胃肠道、肝肺胰肾前列腺、视网膜大脑内耳等类器官（三胚层皆有）。类器官可应用于研究干细胞特性和niche的信号调控。与遗传学、转录组和蛋白质组学相结合，类器官都可用于揭示发育、内稳态和疾病的过程和调控机制。可产生难以在动物身上形成的人类疾病模型。结合高通量临床前筛查，可进行新药筛选，或筛选有效或毒性药物，进行针对性的个性化治疗。再生治疗中除提供组织来源外，应用基因编辑，可获得纠正遗传缺陷后的类器官移植治疗。
未来类器官优化方面：培养基不含鼠源成分，ECM利于药物渗透和能够模拟肿瘤重塑，器官特异分化调控因子的研究/niche微环境和调控因子的研究，形成包含间质细胞、免疫细胞等的复杂性结构的组织/器官，能形成类似体内的信号浓度梯度，能模拟细胞间的相互作用力等。
Inall，此文包括原始组织、ESC/iPSC来源类器官的进展，类器官的应用、优势、不足和相对策略。
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